Der Kaiser betrat Oberitalien im August 1237 mit einem starken Heer von 12.000 - 15.000 Mann. Weil die alten Lehensaufgebote wenig effektiv waren und die Heerfolge sich auf wenige Monate beschränkte (der Zug sollte erheblich länger dauern), bestand die Truppe hauptsächlich aus sizilianischen, italienischen und deutschen Söldnern. Den Kern bildeten die gepanzerten Reiter, unterstützt von leichten Fußtruppen und den gefürchteten sarazenischen Bogenschützen. Die Heere dieser Zeit waren nur für offene Feldschlachten geeignet, für eine offensive Belagerung fehlten Artillerie und effektive Belagerungsmaschinen. Belagerung waren deshalb meist mühsam zeitraubend und (wegen des hohen Söldneranteils) teuer, nur selten gelang die Einnahme einer Stadt mit einem Sturmangriff.
Friedrich II. versuchte deshalb, direkte Angriffe auf die Städte zu vermeiden und stattdessen die lombardischen Truppen im offenen Feld anzugreifen. Die Stadt Mantua kapitulierte nach der Einnahme einiger Burgen im September 1237, daraufhin wandten sich die Kaiserlichen gegen Brescia, wo ein starkes Bundesheer von 10.000 Soldaten stand, das im Schutz der Stadtmauern gut versorgt war und keine Angriffsmöglichkeit bot. Der Kaiser zog sich zum Schein zurück, entließ die oberitalienischen Kontingente und legte sich mit dem Restheer in einen Hinterhalt. Die Lombarden gingen in die Falle und wurden bei Cortenuova vernichtend geschlagen: der Kaiser machte gewaltige Beute (u.a. den mailändischen Fahnenwagen) und nahm Pietro Tiepolo, den Sohn des venezianischen Dogen gefangen. Der Sieg wurde mit einem antiken Triumhzug gefeiert, den Fahnenwagen ließ Friedrich II. in Rom auf dem Forum aufstellen. Damit betonte er die römische Komponente seiner Herrschaft. Er befand sich auf dem Höhepunkt seiner Macht, viele Städte der lombardischen Liga traten zu ihm über, sogar die Mailänder war zu Verhandlungen bereit: sie wollten Geiseln stellen und einen kaiserlichen Beauftragten als obersten Richter akzeptieren.
Aus blindem Haß lehnte der Staufer gegen jede Staatsklugheit ab und forderte die völlige Unterwerfung der Städte. Auf dem Reichstag in Verona im Frühjahr 1238 konnte er eine gewaltige Heeresmacht versammeln, mit der er Ende Juli begann, Brescia zu belagern. Die Stadt erwies sich als uneinnehmbar, hinzu kamen Seuchen im kaiserlichen Heer, so daß die Aktion im Oktober erfolglos abgebrochen werden mußte. Diese schwere Schlappe Friedrich II. ermutigte die Lombardenstädte, die außerdem vom Papst massiv unterstützt wurden. Seit dem Spätsommer 1238 stellte sich Gregor IX. offen gegen den Kaiser, einerseits wegen dessen zu großer Machtfülle, andererseits wegen der offenbar geplanten Eingliederung Roms in den kaiserlichen Herrschaftsbereich.
Seit dem 11. Jahrhundert hatte die stadtrömische Bevölkerung häufiger versucht, den päpstlichen Stadtherren zu entmachten, der letzte Versuch 1148 durch Arnold von Brescia war nur knapp gescheitert. Ähnliche Bestrebungen gab es in vielen Städten, in Rom wurden sie durch die antike Tradition des Senats verstärkt. Dazu suchten die Römer meist die Unterstützung oder zumindest die Duldung der deutschen Könige (die den Papst als Koronator des Kaisers brauchten), indem sie ihnen eine vom Senat verliehene Kaiserwürde versprachen. Friedrich II. unterstützte diese Tendenzen, um seine „römische“, an Augustus ausgerichtete Herrschaft zu bekräftigen und versprach, Rom wieder zum caput mundi, zum Zentrum eines neuen römischen Kaiserreiches zu machen. Die Position Gregor IX., der schon beim letzten Aufstand aus Rom selbst hatte fliehen müssen, war dadurch sehr bedroht.
Daher suchte er die Verbindung zur lombardischen Liga und schickte den strikt kaiserfeindlichen Kardinal Gregor von Montelongo als Legaten nach Mailand, um die Liga zu einen und zu stärken. Die verfeindeten Seestädte Venedig und Genua konnte er zu einem Angriffspakt gegen den Kaiser überreden und so einen großen antikaiserlichen Machtblock in Oberitalien bilden. Hinzu kam ein Umschwung der Stimmung in Rom zugunsten des Papstes, die Stauferanhänger wurden vertrieben, ihre Häuser niedergebrannt. Friedrich II. suchte zunächst Verhandlungen, die aber wegen der Kompromißlosigkeit der Kurie scheiterten.
Der endgültige Bruch begann schließlich mit der Vermählung des Kaisersohnes Enzio mit der Erbin des sardinischen Königreiches und der Krönung Enzios zum König von Sardinien. Der Papst protestierte und erhob die Lehenshoheit über die Insel. Die Rechtslage war äußerst unklar: Genua und Pisa hatten das Gebiet zwar im Auftrag des Papstes von den Sarazenen übernommen, waren aber dann von Friedrich I. Barbarossa damit belehnt worden. Friedrich II. schrieb nun an das Kardinalskollegium und drohte mit Vergeltung, falls Gregor IX. nicht einlenkte. Auf den Versuch, die Kardinäle gegen den Papst auszuspielen, antwortete Gregor IX. am 20. März 1239 mit dem erneuten Kirchenbann gegen Friedrich II. Als Begründung führte er Übergriffe des Kaisers in kirchlichen Angelegenheiten auf Sizilien an sowie die Unterstützung einer Verschwörung in Rom. Am gleichen Tag starb der große Vermittler des Staufers, der Großmeister des Deutschen Ordens Hermann von Salza, in Salerno, kurz darauf auch sein Pendant auf kirchlicher Seite, Kardinal Thomas von Capua. Damit war ein Frieden unmöglich geworden und der Endkampf zwischen Kurie und staufischem Kaisertum eingeleitet.